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近年來，小核酸藥物研發和臨床治療取得了多項突破性成果，已成為全球投資新風口和生物制藥ju頭的必爭之地，核酸療法進入快車道。核酸適配體藥物作為核酸療法的重要組成部分，具有許多du特優勢，在醫藥研發領域有著廣闊的市場前景。
一、核酸適配體藥物介紹
核酸適配體（Aptamer）是指通過指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）得到的一段長度在20～100 nt左右的單鏈DNA或RNA序列，可以作為靶向性治療的分子探針。SELEX技術的初始文庫是單鏈DNA或RNA文庫，由1014~1016個隨機的長度為20～100個核苷酸序列的寡核苷酸組成，兩端為固定引物序列，中間有一個隨機區域。初始文庫與靶標物質孵育后，結合的寡核苷酸從未結合序列中分離并通過PCR擴增，得到的富集池投入下一輪的篩選，不斷循環最終找到高親和力適配體。(圖1）
圖1 SELEX篩選過程示意圖
(來源：核酸適體的篩選及其在生物醫學領域的研究進展）
核酸適配體可折疊形成發卡（hairpin）、假結（pseudoknot) 、凸環（bulge）、G-四聚體（G-quadruplex）等穩定的二級和三級空間結構。核酸適配體的這些空間構型能夠與靶標物質通過靜電作用、氫鍵作用、堆積作用、疏水作用和形狀匹配等多種相互作用力形成嵌合或包被的高親和力復合物，從而實現對靶標物質的高度特異性識別結合。（圖2）
圖2 核酸適配體折疊識別結合靶標示意圖
(來源：Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies）
核酸適配體能夠識別、結合的靶標物質范圍非常廣泛，包括金屬離子、小分子、氨基酸、多肽、蛋白質、生長因子、細胞粘附分子，甚至是完整的細胞、病毒等。核酸適配體具有與抗體相當的親和力，其親和常數可達納摩爾或皮摩爾水平，因此被稱為“化學抗體"。然而同抗體相比核酸適配體具有更大的優勢，其中包括具有更好的組織穿透性、更高的熱穩定性、更低的免疫原性、更易生產以及可以在不喪失活性的情況下在適配體的天然寡核苷酸骨架中引入各種化學修飾等。表1所示為核酸適配體和抗體的對比情況。
表1 核酸適配體和抗體對比
Criteria | Aptamers | Antibody |
Basic composition | Nucleotide (four members: A, G, T/U and C) | Amino acid (20 members) |
Materials | Nucleic acid (single-stranded DNA or RNA) | • Protein (polymer peptide) •Antibodies consist of two light chains and two heavy chains |
Molecular weight and/or size | • 6–30kDa (20–100nt) • ~2nm | • 150–180kDa • ~15nm |
Secondary structure | •Hairpin, stem, loop, bulge, G-quadruplex or kissing complex | • α-Helix and β-fold |
Binding pattern and/or mechanism of action | • Surface recognition • Three-dimensional interactions via van der Waals forces, hydrogen bonding and electrostatic interactions similar to the way antibodies bind to antigen • Reversal of activity via complementary antidote oligonuclotides | • Binding pocket (key and lock model) • Three-dimensional interaction; antibodies recognize epitopes located on the target antigen
|
Affinity
| •High • Mul`tivalent aptamers can confer increasing affinity and additional functions | •High •Affinity between antibody and antigen depends on the number of identical epitopes on the target antigen |
Specificity
| •High • The aptamer is able to identify single point mutations and conformational isomers | •High •Antigens may have multiple epitopes, which allow different antibodies to bind to the same antigen |
Potential targets
| •Wide range: ions, organic and inorganic molecules, nucleic acids, peptides, proteins, toxins, viral particles, whole cells, entire organs and live animals | • Limited to immunogenic molecules •No toxins or other molecules that do not cause strong immune responses |
Generation and discovery | • In vitro SELEX (2–15 selection rounds) • ~2–8 weeks •Aptamer can be selected in hours or days via high-throughput automated SELEX | • In vivo biological system • ~6 months or longer |
Manufacturing and costs
| •Chemical solid-phase synthesis •Controllable and completely in vitro procedure • 2 days for milligrams; 2 weeks for grams •No or low risk of contamination • Facile regulatory affairs and cGMP • Low cost for DNA; high cost for long RNA (>60nt) with special modifications •Costs lowered with the development of new technology | • In vivo (animal-based production) • Potential contamination due to cells or animal-based production • 3 months for 5–20 grams • From mammalian cells: high cost • From transgenic plants or animals: low cost
|
Batch-to-batch variation | •None or low | • Significant
|
Physical and thermal stability
| •Very stable and long shelf-life • Resistant to high temperature (even up to 95°C) and cycles of denaturation and renaturation •Aptamers can be lyophilized for long-term storage and transport at room temperature
| •Unstable and limited shelf-life • Susceptible to temperature (even at room temperature or 37°C) and irreversible denaturation • Requires refrigeration for storage and transport |
Chemical modification and conjugation
| •Convenient and controllable •Various types available, including sugar, backbone, base and other modifications •Aptamers can be rationally modified without loss of binding affinity
| • Restricted and uncontrollable • Limited types and chemical reactions • Stochastic modifications very likely to cause negative consequences, such as loss of activity
|
Tissue uptake and penetration | • Faster
| • Slower
|
Immunogenicity | •None or low immunogenicity | •High immunogenicity • Increased immune reaction with repeated dosing |
Nuclease degradation | •Vulnerable • Limited half-life in vivo (~10min for unmodified version) | • Resistant and not affected by nucleases in vivo |
Kidney filtration
| • Faster • Short circulation time in vivo (~30min for unconjugated version) | • Slower • Long circulation time (up to 1 month)
|
Patents and distribution | • Exclusive patents in SELEX technology • Limited initial distribution | • Expired protection or no early patents • More widespread distribution |
Development and market | • The development pathway is less explored • Insufficient education and investment (R&D support) •Commercialization has focused on diagnostic-based aptamer products | •Well-developed infrastructure •Abundant support from finance and education • Rapid and sustained increase in drug market share |
cGMP, current good manufacturing practice; nt, nucleotide; SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment.
來源：Aptamers as targeted therapeutics: current potential and challenges
憑借其諸多du特的優勢，核酸適配體在藥物研發領域發展前景廣闊。美國 FDA 在 2004年通過了第一個用于治療年齡相關的黃斑變性的核酸適配體藥物哌加他尼鈉 ( pegaptanib sodium，商品名為Macugen) ，將核酸適配體藥物的研發推向一個新的高度。現已有11種核酸適配體藥物進入臨床試驗階段（表2），未來必定會有更多的核酸適配體藥物被研發出來，并最終用于治療疾病。
表2 進入臨床階段的核酸適配體藥物
藥物名稱 | 性質 | 靶標 | 治療疾病 | 臨床階段 | 時間 | 研究單位 |
Pegaptanib | RNA | VEGF | AMD | 上市（現已退市） | 2004 | Eyetech/Pfizer公司 |
Zimura | RNA | C5 | AMD | Ⅰ期 | 2016 | Ophthotech公司 |
Fovista | DNA | PDGF | AMD | Ⅲ期 | 2016 | Ophthotech公司 |
AS1411 | DNA | 核仁蛋白 | 腎癌 | Ⅱ期 | 2008 | Antisoma研究中心 |
NOX-A12 | RNA | CXCL12 | CLL | Ⅰ期 | 2012 | NOXXON制藥公司 |
NOX-E36 | RNA | CCL2 | DN | Ⅰ期 | 2015 | NOXXON制藥公司 |
ARC1779 | DNA | VWF | TTP | Ⅱ期 | 2008 | Archemix公司 |
ARC19499 | RNA | TFPI | 血友病 | Ⅰ期 | 2010 | 維也納醫科大學 |
NU172 | DNA | 凝血酶 | 心臟病 | Ⅱ期 | 2013 | ARCA生物制藥公司 |
REG1 | RNA | FIXa | 冠狀動脈疾病 | Ⅱ期 | 2007 | Regado生物科學公司 |
NOX-H94 | RNA | 鐵調素 | ACI | Ⅱ期 | 2013 | NOXXON制藥公司 |
數據來源：核酸適配體藥物的研究進展
二、核酸適配體藥物體外代謝研究策略
和傳統小分子藥物一樣，在藥物臨床前研究階段，通常需要對Aptamer藥物進行體外代謝研究，并提供代謝途徑及其產物相關信息。Aptamer藥物的代謝酶主要為核酸外切酶和核酸內切酶，廣泛分布于血液和各個組織器官，一個合適的體外代謝研究體系，能夠最da程度地預測體內的情況，對于Aptamer藥物的早期篩選非常重要。表3所示為常用的Aptamer藥物體外代謝研究體系。
表3 Aptamer藥物的體外代謝研究體系
生物基質 | 試驗類型 | 備注 |
血清/血漿 | 代謝穩定性，血漿蛋白結合試驗 | 金屬螯合劑抗凝的血漿不適合代謝穩定性研究。 |
肝S9 | 代謝穩定性，代謝產物鑒定 | 肝S9一定程度上可以代替肝組織勻漿使用。 |
肝微粒體 | 代謝穩定性 | 肝微粒體的核酸酶活性較低，可以根據實際情況進行選擇。 |
肝組織勻漿 | 代謝穩定性，代謝產物鑒定 | 酶體系比較全面，推薦用于Aptamer藥物的體外篩選評價。 |
肝細胞 | 代謝穩定性，代謝產物鑒定 | 肝細胞酶體系最為*，適用于肝靶向的Aptamer藥物研究。 |
溶酶體 |
代謝穩定性 | 溶酶體具有豐富的酶體系，包括核酸酶和各種水解酶等，是研究Aptamer藥物代謝穩定性的高效實驗體系。 |
三、IPHASE相關產品
為滿足客戶對于Aptamer藥物體外代謝研究的需求，IPHASE作為體外研究生物試劑引ling者，憑借先進的設備，專業的技術人員和多年研發的經驗，開發出來多種用于Aptamer藥物體外代謝研究的產品，助力廣大客戶進行Aptamer藥物早期篩選研究。
類別 | 分類 |
亞細胞組分 | 肝溶酶體 |
酸化肝勻漿液 | |
肝/腸/腎/肺S9 | |
肝/腸/腎/肺微粒體 | |
肝/腸/腎/肺胞質液 | |
原代肝細胞 | 懸浮肝細胞 |
貼壁肝細胞 | |
專屬血漿 | 血漿穩定性 |
血漿蛋白結合 |
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參考文獻：
[1] Shuanghui Yang, Huan Li, Ling Xu, et al. Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2018, 13, 164-165.
[2] Jiehua Zhou, John Rossi. Aptamers as targeted therapeutics: Current potential and challenges. Nat. Rev. Drug Discovery. 2017, 16(3): 181-202.
[3] 靳貴曉，李娟，楊黃浩. 核酸適體的篩選及其在生物醫學領域的研究進展[J]．福州大學學報，2016，44(6):920-934.
[4] 劉珊，肖楠，王睿，等. 核酸適配體藥物的研究進展[J]．生命科學儀器，2020，18:16-24.
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